МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНА САНІТАРНО-ЕПІДЕМІОЛОГІЧНА СЛУЖБА
ГОЛОВНИЙ ДЕРЖАВНИЙ САНІТАРНИЙ ЛІКАР УКРАЇНИ
П О С Т А Н О В А
28.01.2004 N 4
Про погодження методик
визначення біологічних речовин
Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення
санітарного та епідеміологічного благополуччя населення"
( 4004-12 ) П О С Т А Н О В Л Я Ю:
1. Погодити рекомендовані Комітетом з питань гігієнічного
регламентування Міністерства охорони здоров'я України методики
визначення біологічних речовин:
1.1. Методичні вказівки з визначення мікробного родентициду
бактероденциду в повітрі робочої зони. Розробники: Інститут
агроекології та біотехнології УААН та бактеріологічна лабораторія
Київської міської СЕС (додається) (не наводиться);
1.2. Методичні вказівки з визначення мікробного препарату
триходерміну в повітрі робочої зони. Розробник: Інститут
агроекології та біотехнології УААН (додається) (не наводиться);
1.3. Методичні вказівки "Визначення кількості біфідобактерій
у кисломолочних продуктах. Розробники: Український
науково-дослідний інститут харчування та Технологічний інститут
молока та м'яса (додається).
2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного
нагляду Міністерства охорони здоров'я України дану постанову
довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної
служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади у
встановленому порядку.
Головний державний санітарний
лікар України О.В.Лапушенко
ПОГОДЖЕНО
Постанова Головного
державного санітарного
лікаря України
28.01.2004 N 4
10. Методи контролю
10.2 Біологічні та мікробіологічні чинники
10.2.2 У продовольчій сировині та продуктах харчування
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
Визначення кількості біфідобактерій
у кисломолочних продуктах
Методичні вказівки з методів контролю
МВК 10.10.2.2.-119-2005
Галузь застосування
Методичні вказівки встановлюють методику проведення
лабораторних досліджень (випробувань) для визначення кількості
біфідобактерій у кисломолочних продуктах.
Методичні вказівки призначені для застосування в лабораторіях
організацій, незалежно від форм власності, які здійснюють
виробничий контроль якості при розробці, постановці на виробництво
і в процесі промислового випуску кисломолочних продуктів; в
лабораторіях установ державної санітарно-епідеміологічної служби
України, а також в лабораторіях інших організацій, які
акредитовані в установленому порядку на право проведення
досліджень вказаної продукції.
1. Загальні положення
1.1 Основними представниками нормальної кишечної мікрофлори є
анаеробні мікроорганізми, серед яких значне місце займають
біфідобактерії. Здоров'я дитини у перші роки життя багато в чому
залежить від вмісту біфідобактерій в кишечнику. З віком частка
біфідобактерій в загальному біоценозі здорової людини знижується,
однак залишається домінуючою групою.
1.2 Вироблені з використанням біфідобактерій кисломолочні
продукти набувають лікувальних властивостей внаслідок того, що в
них накопичуються в процесі життєдіяльності заквашувальних
мікроорганізмів ферменти, амінокислоти, органічні і
антибактеріальні речовини. Найчастіше у виробництві
використовуються п'ять видів біфідобактерій: B. bifidum, B.
longum, B. infantis, B. breve, B. adolescentis.
1.3 Корисні властивості біфідобактерій добре поєднуються з
харчовими і дієтичними властивостями молока, в той же час
коров'яче молоко не є адекватним середовищем для біфідобактерій,
тому традиційні технології виробництва молочних продуктів з їх
використанням виявилися малопридатними.
1.4 Для виробництва кисломолочних продуктів використовують
переважно заквашувальні препарати, в яких біфідобактерії
поєднуються з іншими мікроорганізмами, в основному молочнокислими,
тому визначення вмісту біфідобактерій доволі складне. Це питання
вирішується застосуванням спеціальних розчинів, які запобігають
розвитку супутньої мікрофлори та не діють на біфідобактерії.
2. Нормативні посилання
Закон України "Основи законодавства України про охорону
здоров'я" від 19.11.92 N 2801-XII ( 2801-12 )
Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного
благополуччя населення" від 24.02.94
N 4004-XII ( 4004-12 )
Закон України "Про якість та безпеку харчових продуктів та
продовольчої сировини" від 23.12.97
N 771/97-ВР ( 771/97-ВР )
Закон України "Про захист прав споживачів" від 12.05.91
N 1023-XII ( 1023-12 )
Указ Президента "Про заходи щодо посилення державного захисту
України прав споживачів" від 12.01.2002 р. N 16/2002
( 16/2002 )
ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы
микробиологического анализа"
ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Отбор проб и
подготовка к испытаниям"
ОСТ 42-21-2-85 "Стерилизация и дезинфекция изделий
медицинского назначения. Методы, средства
и режимы"
МБТ и СН N 5061-89 "Медико-биологические требования и санитарные
нормы качества продовольственного сырья
и пищевых продуктов"
ДСП 9.9.5.-080-02 "Правила влаштування і безпеки роботи в
лабораторіях мікробіологічного профілю"
3. Методи відбору проб
3.1 Відбір проб - за ГОСТ 9225, ГОСТ 10444.11.
3.2 Для аналізу відбирають 3 одиниці споживчої тари методом
випадкової вибірки.
3.3 Посуд з пробою або пробу в споживчій тарі супроводжується
якісним посвідченням, актом відбору, в яких вказують:
- номер проби;
- найменування продукту;
- номер і об'єм партії;
- дату і годину відбору проби;
- посаду і підпис особи, яка відбирала пробу;
- позначення діючої нормативної документації, згідно з якою
вироблявся продукт.
3.4 Пробу, яку відправляють в лабораторію за межі даного
підприємства, пломбують або опечатують і супроводжують якісним
посвідченням, направленням, протоколом та актом відбору зразків, у
яких вказують:
- номер проби;
- найменування підприємства-виготовника;
- найменування продукту;
- номер і об'єм партії;
- дату і годину вироблення продукту з моменту закінчення
технологічного процесу;
- дату і годину відбору проби;
- посаду і підпис особи, яка відбирала пробу;
- обсяг необхідних аналізів;
- позначення діючої нормативної документації, згідно з якою
вироблявся продукт;
- посаду і підпис посадової особи підприємства, на якому
здійснюється контроль продукту.
3.5 Мікробіологічні аналізи продукту проводять не пізніше ніж
через 4 години з моменту відбору проб.
3.6 Проби повинні зберігатись і транспортуватись до початку
досліджень при температурі 4+-2 град.C, не допускаючи при цьому
підморожування.
4. Засоби вимірювальної техніки,
обладнання, реактиви, матеріали
Агар мікробіологічний за ГОСТ 17206-84;
баня водяна з терморегулятором;
бромтимоловий синій за ТУ 6-09-20-86-77;
вата медична гігроскопічна за ГОСТ 5556-81;
випромінювач бактерицидний настінний;
вода очищена аналітичної якості або вода дистильована за
ГОСТ 6709-72;
вода питна за ГОСТ 2874-82;
воронки скляні за ГОСТ 25336-82;
глюкоза, ч. за ГОСТ 6038-79;
годинник механічний сигнальний за ГОСТ 3145-84;
годинник пісковий настільний на 1,5 та 10 хв.;
D-лактоза 1-водна за ТУ 6-09-22-98-79;
іономер універсальний ЕВ-74 або потенціометр pH-340 за
ГОСТ 9245-79;
екстракт кукурудзи згущений за ТУ У 18.243-95;
електроплитка за ГОСТ 14919-83;
ефір для наркозу;
калій двохромовокислий (біхромат калію) за ГОСТ 4220-75;
калію гідрооксид за ГОСТ 4328-77;
калій фосфорнокислий двохзаміщений 3-водний за ГОСТ 2493-75;
каструлі емальовані за ГОСТ 24778-81;
кислота аскорбінова - за ГФ СССР. X ст. 6;
кислота молочна харчова за ГОСТ 490-79;
кислота сірчана, ч. за ГОСТ 4204-77;
кислота соляна, х. ч. за ГОСТ 3118-77;
колби виконання 2, 2-го класу точності, об'ємом 100, 200,
500, 1000 (куб.см) за ГОСТ 1770-74Е;
літій хлористий (Lithium chloride L 4408) - реактив фірми
Sigma;
магній сірчанокислий 7-водний за ГОСТ 4165-78;
марля медична за ГОСТ 9412-77;
метиленовий блакитний;
мікрокалькулятор;
мікроскоп біологічний з імерсійною системою за ГОСТ 8284-78;
налідиксова кислота (Nalidixic acid N 8878) - реактив фірми
Sigma;
натрію гідрокарбонат за ГОСТ 4201-79;
натрію гідроокис, ч. д. а. за ГОСТ 4328-77;
натрію цитрат тризаміщений за ГОСТ 22280-87;
натрій хлористий (натрію хлорид) за ГОСТ 4233-77;
неоміцин сульфат (Neomycin sulfate N 1876) - реактив фірми
Sigma;
ножиці медичні за ГОСТ 21239-89;
олівець або маркер для скла;
освітлювач до мікроскопу типу OI-9, OI-18 або інших марок;
палички скляні;
папір фільтрувальний лабораторний за ГОСТ 12026-76;
паромоміцин сульфат (Paromomycin sulfate P 9297) - реактив
фірми Sigma;
пептон ферментований сухий для бактеріологічних поживних
середовищ за ГОСТ 13805-76;
пергамент за ГОСТ 1341-84;
печінковий відвар;
петлі бактеріологічні;
пінцет медичний за ГОСТ 21241-89;
піпетки виконання 5, 1, 2-го класів точності, об'ємом
1 куб.см;
пляшки скляні для хімічних реактивів за ГОСТ 15844-92;
пробірки типові П1, П2 (діаметром 16 мм, висотою 150 мм і
діаметром 21 мм, висотою 200 мм) за ГОСТ 25336-82;
середовище кукурудзяно-лактозне (ГМК-1) для біфідобактерій;
система очищення води (дистилятор електричний);
скельця предметні для мікропрепаратів за ГОСТ 6672-75;
спирт етиловий ректифікований технічний за ГОСТ 18300-87;
спиртівки лабораторні скляні за ГОСТ 23932-90 або газові
пальники;
стакани типу ВН об'ємом 100, 200 куб.см;
стерилізатори парові медичні або аналогічні за ГОСТ 19569-89;
стерилізатори медичні парові та повітряні за ГОСТ 27437-87;
сумки-холодильники;
терези лабораторні загального призначення 2-го і 4-го класу
точності за ГОСТ 24014-80Е;
термометр ртутний з діапазоном вимірювання від 0 град. до
100 град.C, з ціною поділки шкали 1 град.C за ГОСТ 13646-68;
термометр рідинний (не ртутний) з діапазоном вимірювання від
0 град. до 100 град.C, з ціною поділки шкали 1 град.C за
ГОСТ 28498-90;
термометри спиртові для контролю температури в холодильниках;
термостати електричні для вирощування бактерій з автоматичним
терморегулятором ТС-80 та інші аналогічні марки;
тести для контролю роботи стерилізаторів;
хлороформ за ГОСТ 20015-88;
холодильник побутовий електричний за ГОСТ 16317-87;
чашки бактеріологічні (Петрі) за ГОСТ 23932-90 або
полістиролові;
циліндри виконання 1 об'ємом 100, 500 (куб.см) за
ГОСТ 1770-74Е;
цистеїн солянокислий (L-cystein hydrochloride C 4820) -
реактив фірми Sigma;
шуттель-апарат;
шафа сушильна стерилізаційна, яка підтримує температуру
(160+-5) град.C;
шпагат за ГОСТ 16266-70;
шпателі металеві або порцелянові 15-20 см за ГОСТ 10778;
штатив пластмасовий за ГОСТ 12026 або металевий.
Дозволяється використовувати інші засоби вимірювальної
техніки, обладнання, реактиви, матеріали, які за технічними
характеристиками подібні вказаним вище і дозволені до використання
в Україні.
5. Підготовка посуду і матеріалів
5.1 Весь новий посуд, який призначений для контролю кількості
біфідобактерій, кип'ятять у підкисленій воді (розчин соляної
кислоти з об'ємною часткою 1-2%) протягом (15+-5) хв. і потім
обполіскують дистильованою водою. Посуд, який був у використанні,
миють 0,5%-ним лужним розчином за допомогою йоржів та щіток,
обполіскують водопровідною водою. Сильно забруднений посуд зі
слідами жиру, фарби, імерсійної олії занурюють на 2 год. у хромову
суміш, підігріту до 40-45 град.C, потім ретельно промивають
проточною водопровідною водою.
5.2 Вимитий посуд висушують при кімнатній температурі або
гарячим повітрям.
5.3 Предметні скельця після мийки та обполіскування обсушують
чистою серветкою або занурюють у склянку з притертою пробкою в
суміш етилового спирту і наркозного ефіру у співвідношенні 1:1.
5.4 Лабораторний посуд перед використанням обов'язково
стерилізують. Стерилізацію здійснюють сухим жаром у сушильній шафі
при температурі (160+-5) град.C протягом 150 хв. або паром в
стерилізаторі при 2 атм (134+-1) град.C протягом (60+-1) хв.
5.5 Пробірки, флакони, пляшки, колби закривають
ватно-марлевими пробками. Зверху пробки (крім пробірок) обгортають
паперовим ковпачком, який обв'язують навколо горла ниткою.
Гумові, коркові, скляні пробки, обгорнуті в папір,
стерилізують окремо.
5.6 Стерильний посуд зберігають в герметично закритих шафах
або ящиках з кришками. Термін зберігання стерильного посуду - не
більше 30 діб, якщо обгортка не порушена.
6. Приготування поживних середовищ і реактивів
6.1 Ізотонічний (фізіологічний) 0,85%-ний розчин натрію
хлористого.
Для приготування ізотонічного розчину активною кислотністю
(70+-0,1) од. pH використовують дистильовану воду, pH якої
перевіряють індикатором бромтимоловим синім. При його додаванні
колір води повинен бути пляшково-зелений. В іншому разі воду не
використовують.
В 1 куб.дм води розчиняють 8,5 г натрію хлористого,
розливають розчин у чисті пробірки діаметром 18-20 мм по
10 куб.см, а в колби по 93 куб.см і стерилізують протягом
(20+-1) хв. при температурі (121+-1) град.C.
6.2 Розчин натрію гідрокарбонату для нейтралізації.
10 г натрію гідрокарбонату поміщають у мірну колбу місткістю
100 куб.см, розчиняють дистильованою водою, доводять об'єм до
мітки. Розчин розливають у пробірки і стерилізують при
(121+-1) град.C протягом (30+-1) хв.
6.3 Приготування реактивів метиленового блакитного.
6.3.1 Приготування базового спиртового розчину метиленового
блакитного.
10 г метиленового блакитного змішують з 100 куб.см 96%-ого
етилового спирту. Розчин витримують у термостаті за температури
(37+-1) град.C протягом (24+-1) год., а потім фільтрують також при
температурі (37+-1) град.C.
Термін зберігання базового розчину метиленового блакитного в
термостаті при температурі (37+-1) град.C - не більше трьох
місяців за умов герметичності.
6.3.2 Приготування робочого розчину метиленового блакитного.
Базовий розчин поміщають у водяну баню при температурі
(45+-1) град.С на (8+-2) хв., перемішують до повного розчинення
кристалів. Потім швидко охолоджують до температури (20+-1) град.C
і 5,0 куб.см цього розчину додають до 195 куб.см дистильованої
кип'яченої води. Суміш добре перемішують. Термін зберігання
робочого розчину метиленового блакитного в термостаті при
температурі (8-10) град.C - не більше 7 діб.
6.3.3 Приготування робочого розчину метиленового блакитного
для фарбування препаратів.
До 30 куб.см базового спиртового розчину метиленового
блакитного додати 100 куб.см дистильованої води та 1 куб.см
розчину гідроокису калію з масовою концентрацією 10 г/куб.см.
6.4 Приготування суміші антибіотиків ННПЛ (розчин
налідиксової кислоти, неоміцину, паромоміцину, літію хлористого).
Розчиняють (0,03+-0,001) г налідиксової кислоти,
(0,2+-0,05) г неоміцину, (0,25+-0,05) г паромоміцину та
(6,0+-0,1) г літію хлористого у (100+-1) куб.см, стерилізують
холодною стерилізацією і зберігають при температурі (4+-1) град.C
до застосування. (Суміші антибіотиків ННПЛ рекомендуються
Міжнародною молочною федерацією).
6.5 Модифіковане печінкове середовище Блаурокка.
0,5 кг свіжої яловичої печінки очистити від плівок і
протоків, подрібнити, залити 1 куб.дм дистильованої води і
кип'ятити протягом 1,5-2 год. Відвар профільтрувати, довести до
1 куб.дм. Додати на 1 куб.дм: натрію хлориду - 5,0 г, пептону -
10,0 г; встановити активну кислотність pH (7,15+-0,5) за допомогою
10%-ого розчину гідроокису натрію. Кип'ятити 10 хв. Стерилізувати
при (80+-2) град.C (30+-1) хв. Наступної доби печінковий бульйон
декантувати, додати дистильовану воду до 1 куб.дм. Внести на
1 куб.дм бульйону: глюкози - 5,0 г, агар-агару - 0,8 г, цистеїну -
0,3 г. Кип'ятити 10 хв., довести pH до (7,7+-0,1) хв. Розлити у
пробірки по 10 куб.см і стерилізувати при (121+-1) град.C протягом
(15+-1) хв. або (20+-1) хв. при (112+-1) град.C.
Середовище перевіряють на стерильність шляхом інкубації при
температурі (37+-1) град.C протягом двох діб.
Стерильне середовище Блаурокка зберігають не більше одного
місяця при температурі (20+-2) град.C і не більше двох місяців при
температурі (4+-2) град.C.
Ростові якості середовища Блаурокка контролюють внесенням
ліофілізованої біомаси біфідобактерій. Рекомендується
використовувати середовище Блаурокка промислового виробництва.
Увага! Приготування кукурудзяно-лактозного та
молочно-гідролізатного середовища в лабораторних умовах досить
складне, всі компоненти повинні бути гарантованої якості.
6.6 Кукурудзяно-лактозне середовище (агаризоване).
В невеликій кількості дистильованої води розплавляють агар в
кількості 2,5 г на 1 куб.дм середовища. До решти дистильованої
води додають 10 г пептону, 40 куб.см водного розчину кукурудзяного
екстракту, який розведений 1:6,6 г натрію лимоннокислого
тризаміщеного, 0,12 г магнію сірчанокислого, 2 г калію
фосфорнокислого двозаміщеного. Суміш нагрівають до температури
(80+-2) град.C, після чого змішують з розплавленим агаром, додають
10,0 г лактози і 0,15 г цистеїну солянокислого або 0,15 г
аскорбінової кислоти. Попередньо цистеїн розчиняють у невеликій
кількості дистильованої води, в якій встановлюють pH (8,45+-0,5)
за допомогою 10%-ого розчину гідроокису натрію і нагрівають на
водяній бані до повного розчинення. У суміш до потрібного об'єму
(1 куб.дм) доливають гарячу дистильовану воду і встановлюють
pH (7,05+-0,5) за допомогою 40%-ого розчину гідроокису натрію.
Середовище розливають в пробірки високими стовпчиками по
10 куб.см і стерилізують при (112+-1) град.C протягом (30+-1) хв.
6.7 Молочно-гідролізатне середовище.
6.7.1 Відновлене (10%) сухе знежирене молоко об'ємом 1 куб.дм
кип'ятять, охолоджують, встановлюють значення активної кислотності
(7,9+-0,1) од. pH за допомогою 40%-ого розчину гідроокису натрію,
додають 8 куб.см хлороформу, густиною 1,47 та (2,6+-0,1) куб.см
панкреатину, гідролізують протягом 48 год. при (55+-1) град.C,
фільтрують і розводять водопровідною водою у співвідношенні 1:1,
встановлюють pH на рівні (7,3+-0,1) та стерилізують при 121 град.C
протягом 15 хв. У невеликій кількості одержаного гідролізованого
бульйону розчиняють на водяній бані агар із розрахунку (17+-2) г
на 1 куб.дм. До решти бульйону додають (20+-1) г пептону та
(3,5+-0,5) г хлористого натрію. Суміш нагрівають до температури
(80+-2) град.C, після чого з'єднують із розплавленим агаром.
Встановлюють значення активної кислотності (7,5+-0,1) од. pH,
кип'ятять 15 хв., відстоюють, зливають, не фільтруючи, доливають
гарячою дистильованою водою до 1 куб.дм і додають (10+-0,5) г
лактози та (0,15+-0,05) г цистеїну солянокислого. Середовище
розливають по 10 куб.см у стерильні пробірки і стерилізують при
112 град.C протягом 30 хв. Також допускається застосування сухого
поживного середовища, яке виробляється в Росії
(ТУ 9291-094-04610209-2000). Визначення вмісту біфідобактерій з
використанням цього середовища здійснюється наступним чином.
6.7.2 Приготування робочого середовища: (50+-5) г сухого
середовища вносять у (1+-0,05) куб.см холодної води (можливе
використання дистильованої або питної води). Суміш ретельно
перемішують, нагрівають, кип'ятять 3-5 хв. Перевіряють активну
кислотність і при необхідності доводять її 20-30%-ним розчином
гідроокису натрію або 20%-ним розчином молочної кислоти до
pH (7,4+-0,2) од. Середовище розливають в пробірки по
20 куб.см, закривають ватними пробками і стерилізують при
температурі (37+-1) град.C протягом (15+-1) хв.
6.7.3 Використання робочого середовища: безпосередньо перед
застосуванням пробірки з середовищем нагрівають на водяній бані до
кипіння і витримують протягом (25+-5) хв. Після чого середовище
швидко охолоджують до температури (40+-45) град.C. При посіві
уникають струшування і потрапляння всередину стовпчика середовища
повітря з піпетки. При визначенні біфідобактерій в продуктах зі
змішаною мікрофлорою рекомендується до середовища додавати розчин
неоміцину.
Приготування розчину неоміцину: (0,5+-0,01) г неоміцину
розчиняють в (500+-1) куб.см стерильної води. При проведенні
аналізу, в готове середовище перед розплавленням, вносять
0,1 куб.см розчину неоміцину з розрахунку на 20 куб.см середовища.
Допускається додавання водних розчинів антибіотиків до
розплавленого та охолодженого середовища.
Увага! Використання неоміцину не завжди забезпечує повне
пригнічення супутньої мікрофлори, тому рекомендується
застосовувати суміш ННПЛ (п. 6.4).
6.8 Приготування поживних середовищ для ідентифікації
біфідобактерій.
Використовують сухе поживне середовище МРС (середовище
Mann-Rogosa-Scardovi), у яке додають 1% від загального об'єму
відповідного вуглеводу, стерилізують текучою парою або при
(115+-1) град.C 15-20 хв.
Дозволяється використовувати інші сухі поживні середовища,
дозволені до використання в Україні.
7. Визначення кількості біфідобактерій
7.1 Методика заснована на здатності біфідобактерій рости у
поживних середовищах, які розлиті високим стовпчиком у пробірках,
при температурі (38+-1) град.C і утворювати у них через
24-72 години колонії з типовими для біфідобактерій морфологічними
характеристиками.
7.2 Підготування проб до аналізу.
7.2.1 Розкриття пакетів необхідно проводити в асептичних
умовах.
7.2.2 Кожну відібрану пробу (пакування) аналізують окремо.
З кожного пакета після ретельного перемішування піпеткою
відбирається 10 куб.см кисломолочного продукту, які поміщають у
стерильний посуд і потім нейтралізують. Для цього до
10 куб.см взятого продукту в стерильний посуд для аналізу додають
1,0 куб.см стерильного розчину натрію гідрокарбонату з масовою
концентрацією 100 г/куб.дм; суміш ретельно перемішують,
застосовуючи необхідні стерильні пристосування або шуттель-апарат.
pH встановлюють на pH-метрі.
7.2.3 До нейтралізованого зразка продукту додають
фізіологічний розчин до загального об'єму проби 100 куб.см, після
чого суміш знов ретельно перемішують. Таким чином, отримують перше
розведення (1х10-1). Піпетку промивають 10-12 раз отриманою
сумішшю до верхніх поділок.
7.2.4 Подальші десятикратні розведення продукту готують
наступним чином: додають до 9 куб.см фізіологічного розчину по
1 куб.см продукту попереднього розведення. При цьому суміш у
кожному випадку ретельно перемішують. Для приготування окремого
розведення беруть нову стерильну піпетку.
7.3 Проведення дослідження.
Готують 2 ряди поживних середовищ, кожен з яких по
5 пробірок, що містять середовище Блаурокк або інше середовище у
кількості 10 куб.см для висіву з них відповідних розведень взятого
до досліду продукту. Перед вживанням середовище потрібно розігріти
на киплячій водяній бані для зниження в ньому вмісту розчиненого
кисню. При використанні агаризованих поживних середовищ перед
проведенням аналізу їх слід розігріти у киплячій водяній бані до
повного розплавлення агару. Після цього пробірки охолоджують до
47+-1 град.C, додають суміш антибіотиків із розрахунку 0,1 куб.см
на 10 куб.см середовища.
В момент використання температура поживних середовищ повинна
бути (38+-1) град.C.
Внесення посівного матеріалу в середовище здійснюють,
починаючи з останнього розведення: в останню пробірку кожного з
двох рядів середовища вносять по 1 куб.см продукту 1х10-8, 1х10-7,
1х10-6, 1х10-5, 1х10-4. Таким чином, перша пробірка кожного ряду
буде містити розведення продукту 1х10-4, а остання - 1х10-8. Після
внесення розведення продукту в середовище вміст пробірки ретельно
перемішують (наприклад, круговими рухами руки або за допомогою
шуттель-апарату).
7.4 Інкубація.
Пробірки з посівами зразків продукту витримують в термостаті
при температурі (37+-1) град.C протягом (72+-1) год., посіви
переглядають через 24-48 год. Допускається попередній підрахунок
через (48+-1) год. з подальшим остаточним підрахунком через
(72+-1) год.
8. Підрахування колоній і обробка результатів
8.1 Після інкубації відбирають останні пробірки, в яких
виросли колонії, типові для біфідобактерій: у вигляді "гвіздків",
"витягнутих веретен", іноді у вигляді "смуг", які розташовані
вздовж пробірки (у агарізованих середовищах - у вигляді великих
"дисків" або "гречаних зерен"), і записують розведення пробірки.
Підраховують кількість колоній.
8.2 Підтвердження наявності біфідобактерій методом
мікроскопіювання. З типових колоній останнього розведення і з дна
пробірки наступного розведення (без видимого росту типових колоній
біфідобактерій) готують мазки, які фарбують за Грамом або
метиленовим блакитним. Для приготування препарату на чисте
предметне скло за допомогою петлі наносять невелику краплю
матеріалу, що досліджується, і розподіляють на площі біля
1 куб.см. Препарат висушують при кімнатній температурі, фіксують у
полум'ї нагрівача і фарбують метиленовим блакитним або за Грамом.
Біфідобактерії фарбуються метиленовим блакитним у синій колір, а
за Грамом позитивно, і в мазках, звичайно, мають вигляд паличок
різної форми (короткі, правильні, тонкі клітини із загостреними
кінцями; кокоподібні правильні клітини; довгі злегка вигнуті або
із виступами, або надзвичайно різноманітним розгалуженням; гострі,
іноді біфурковані з закругленими або лопатоподібними кінцями;
поодинокі або у ланцюжках, зіркоподібних скупченнях або розміщених
у вигляді літери V, китайських ієрогліфів або палісадно).
Обчислення вмісту живих біфідобактерій в 1,0 куб.см продукту
здійснюють за формулою:
X = a x 10 n, де:
X - кількість живих біфідобактерій в 1,0 куб.см;
a - середня кількість колоній в останньому розведенні, яке
було засіяне в двох рядах;
10 - коефіцієнт децимального розведення;
n - показник останнього розведення продукту, в якому
відмічається ріст біфідобактерій.
При виявленні біфідобактерій мікроскопіюванням мазків
придонного матеріалу з розведення, в якому не спостерігався
видимий ріст колоній, враховують ступінь цього розведення.
За остаточний результат при оцінці якості продукту приймають
середньоарифметичне значення результатів, що були отримані з трьох
відібраних зразків (упаковок).
9. Оцінка результатів контролю
При визначенні біфідобактерій в кількості, яка відповідає
нормі, вказаній в НД на даний вид продукту, роблять висновок про
відповідність продукту вимогам НД за даним показником. При
визначенні вмісту біфідобактерій у продукті нижче нормативного
аналіз слід повторити, при цьому досліджується подвоєна кількість
проб.
При повторному виявленні біфідобактерій в кількості нижче
встановленого нормативу надають рекомендації щодо перевірки
технологічного ланцюга виготовлення продукту.
10. Біологічні властивості біфідобактерій
В разі необхідності може бути проведена ідентифікація
біфідобактерій до виду.
Вперше біфідобактерії, такі як Bacillus bifidus, були
виділені Тісс'є у 1900 році із фекалій немовлят, яких годували
материнським молоком. Надалі їхнє таксономічне положення
неодноразово змінювалося - від pp. Bacteroides, Nocardia,
Lactobacillus до Corinebacterium. У 70-х роках минулого сторіччя
біфідобактерії як окремий вид Bifidobacterium Orla-Jensen були
віднесені до родини Actinomycetaceae на підставі специфічних
фенотипових, біохімічних та генетичних ознак цих мікроорганізмів
(1). Сьогодні цей рід налічує 29 видів, що розрізняються за
походженням, фізіолого-біохімічними та культуральними
характеристиками. Спільною рисою біфідобактерій, за якою вони були
виділені в окремий рід, є наявність ферменту
фруктозо-6-фосфатфосфокетолази.
Здатність біфідобактерій запобігати розвиткові багатьох видів
патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів дозволяє
отримувати продукти, які є ефективними лікувальними засобами при
різноманітних кишкових інфекціях, діареях, дизбактеріозах різного
ступеня та етиології (2, 3). У виробництві лікувальних
ферментованих продуктів та пробіотиків використовуються лише
представники кишечної нормофлори людини та тварин, а саме,
B. bifidum, B. longum, B. infantis, B. breve, B. adolescentis і
B. animalis.
Біфідобактеріям притаманна резистентність до основних
метаболітів і біологічних рідин травного тракту, жовчостійкість.
Характерною рисою біфідобактерій є морфологічна
гетерогенність (2), отже для визначення виду біфідобактерій
застосовують ключі, викладені у Визначнику Bergey's Manual of
systematic bacteriology, та сучасні методи хемо- та генотаксономії
ДНК-ДНК гібридизації, ПЛР тощо.
При поверхневому рості на твердому поживному середовищі в
анаеробних умовах біфідобактерії утворюють добре окреслені
гладенькі, випуклі колонії кремового або білого кольору, блискучі
та м'якої консистенції; у товщі агару - характерні колонії у
вигляді "гречаного зернятка" або "диску" (1).
Специфічність умов існування біфідобактерій загалом визначає
їхні фізіологічні властивості (2). Це - строгі анаероби, іноді
зустрічаються аеротолерантні форми. Мінімальна температура росту
складає 25-28 град.C, максимальна - 43-45 град.C. Для кишечних
видів оптимальна температура та pH для росту - 37-41 град.C та
pH 6,5-7,0, хоча можуть розвиватися у діапазоні pH від 4,5-5,0 до
8,0-8,5.
Тип метаболізму біфідобактерій - як і у молочнокислих
бактерій - бродильний. На відміну від останніх, біфідобактерії
зброджують гексози за альтернативним фосфокетолазним шляхом,
характерним лише для цього роду, який називають "біфідним" шунтом.
Ключовим ферментом цього шляху є фруктозо-6-фосфатфосфокетолаза, а
кінцевими продуктами бродіння - молочна та оцтова кислоти у
співвідношенні 2:3. На відміну від гетероферментативного шляху
молочнокислих бактерій при цьому не утворюється CO .
2
Кожен вид біфідобактерій характеризується власним спектром
зброджуваних вуглеводів. У таблиці 1 відображено здатність до
ферментації вуглеводів для видів, що застосовуються у виробництві
ферментованих молочних продуктів.
Таблиця 1
Розподіл видів біфідобактерій
за спектром ферментованих вуглеводів
------------------------------------------------------------------
| Вуглевод | Bifidobacterium |
| |---------------------------------------------------|
| |adolescentis| bifidum | breve |infantis| longum |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Арабіноза | + | - | - | - | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Целобіоза | + | - | (+)* | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Фруктоза | + | + | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Галактоза | + | + | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Глюконат | + | - | - | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Інулін | (+) | - | (+) | (+) | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Лактоза | + | + | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Мальтоза | + | - | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Манітол | (+) | - | (+) | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Маноза | (+) | - | + | (+) | (+) |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Мелецитоза | + | - | (+) | - | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Мелібіоза | + | (+) | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Рафіноза | + | - | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Рибоза | + | - | + | + | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Саліцин | + | - | + | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Сорбітол | (+) | - | (+) | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Крохмаль | + | - | - | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Цукроза | + | (+) | + | + | + |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Трегалоза | (+) | - | (+) | - | - |
|------------+------------+---------+---------+--------+---------|
|Ксилоза | + | - | - | (+) | (+) |
------------------------------------------------------------------
---------------
* (+) - позитивна реакція, але повільна ферментації.
11. Техніка безпеки
Забезпечуються вимоги щодо техніки безпеки при роботі з
мікроорганізмами (ДСП 9.9.5.-080-02 "Правила влаштування і безпеки
роботи в лабораторіях мікробіологічного профілю", МОЗУ, 2002 р.).
12. Список літератури
1. Bergey's Manual of systematic bacteriology, Vol. 2;
Baltimore - London Los-Angeles - Sydney: Williams and Wirlings,
1986. - р. 14-34.
2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и
функциональное питание. Т. 2: Социально-экологические и
клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и
животных. - М.: "Гранитъ", 1998; Т. 3: Пробиотики и функциональное
питание. - М.: "Гранитъ", 2001.
3. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические
продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. 1999,
N 2, С.32-40.
"Санітарний лікар України", N 1-4, 2005 р.